date:2022-01-13 10:50:18
ibidi µ-Slide18孔載玻片
使用ibidi µ-Slide 18孔載玻片培養(yǎng)，固定和染色貼壁細(xì)胞的簡單方案。在此示例中，我們培養(yǎng)了人內(nèi)皮細(xì)胞，用低聚甲醛固定了它們，并對F-actin細(xì)胞骨架和表達(dá)α-微管蛋白的微管進(jìn)行了染色。細(xì)胞核用DAPI復(fù)染。
該應(yīng)用包括四個主要步驟：
準(zhǔn)備實驗材料如下：
詳細(xì)步驟如下：
01培養(yǎng)
在無菌條件下打開ibidi µ-Slide 18孔ibiTreat（81816）的包裝，并將其放在µ-Slide機(jī)架（80003）上。
準(zhǔn)備細(xì)胞懸液（1 x 105cell/ ml），并在µ-Slide 18孔的每個孔中加100 µl。
用提供的蓋子蓋上腔室。
在潮濕的細(xì)胞培養(yǎng)箱（37°C，5％CO2）中培養(yǎng)過夜。對于更長的細(xì)胞培養(yǎng)，我們建議幾天后進(jìn)行中等程度的交換。
02固定，透化和封閉
使用移液器裝置從孔中吸出細(xì)胞培養(yǎng)基。
用Dulbecco PBS沖洗細(xì)胞，方法是將100 µl緩慢加入每個孔。
用約100 µl 4％多聚甲醛固定細(xì)胞20分鐘。
用PBS沖洗細(xì)胞兩次，方法是將100 µl緩慢加入每個孔中。
除去液體，并在PBS中加入約100 µl的0.1％Triton®X-100。孵育10分鐘。
用PBS洗滌細(xì)胞，緩慢將100 µl加入每個孔中。
除去液體，并在PBS中加入100 µl 1％BSA封閉溶液。孵育20分鐘。
用PBS洗滌細(xì)胞，緩慢將100 µl加入每個孔中。
03染色
準(zhǔn)備您的染色抗體溶液。
使用移液器裝置從孔中吸出所有液體。
將100μlPBS稀釋的一抗（抗-Tubulin 1：1000）稀釋到每個孔中，并在4°C下孵育過夜。
用PBS洗滌細(xì)胞一次，持續(xù)10分鐘。
將100 µl PBS稀釋的二級抗體混合物（抗小鼠IgG-Atto594 1：500和LifeAct-TagGFP2蛋白30 µg / ml）稀釋到每個孔中，并在室溫下于黑暗中孵育3小時。。
用PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次10分鐘。
吸出PBS，并在每個孔中加入約100 µl含DAPI的ibidi封固劑。使用滴管瓶滴加安裝介質(zhì)。
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04顯微鏡檢查
在熒光顯微鏡下用合適的濾光片組觀察細(xì)胞，可選擇用ibidi浸油（50101）觀察細(xì)胞。
（可選）覆蓋圖像以創(chuàng)建合并圖像。
05結(jié)果
接種在µ-Slide 18孔，ibiTreat，物鏡60x，24小時后的HUVEC（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞）。
綠色：F-肌動蛋白（LifeAct-TagGFP2蛋白）
紅色：微管蛋白（單克隆抗α-Tubulin抗體，小鼠+抗小鼠IgG-Atto594）
藍(lán)色：細(xì)胞核（使用具有DAPI的ibidi Mounting Medium進(jìn)行DAPI染色）
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