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　　1. 基本信息

　　下面的應(yīng)用描述了小鼠巨噬細(xì)胞系RAW-264.7（生物安全等級2）在ibidi µ-Slides VI _^0.4 和8孔腔室載玻片的培養(yǎng)方案。這是一個特殊的細(xì)胞系的例子，用于顯示粘附時間，細(xì)胞密度和細(xì)胞形態(tài)的示范。本應(yīng)用可根據(jù)您的具體實驗要求進(jìn)行調(diào)整。

　　2. 材料

　　在設(shè)置中應(yīng)用下列材料：

　　·RAW-264.7 (murine macrophages, CLS - Cell Lines Service, Biosafety Level 2) 

　　·Medium: RPMI 1640 with 2 mM L-Glutamin and 10% FBS 

　　·µ-Slide VI ^_0.4, ibiTreat （ibidi 80606）

　　·µ-Slide 8 well, ibiTreat （ibidi 80826）

　　·Accutase (PAA Laboratories GmbH) 

　　·1x Phosphate buffered saline (PBS) 

　　3. 細(xì)胞培養(yǎng)與材料制備

　　在將細(xì)胞接種到玻片中之前，按照常規(guī)的方法培養(yǎng)細(xì)胞。

　　µ-Slide VI ^_0.4 ：通道玻片和培養(yǎng)基，在37℃和5%CO_²培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。這對于避免隨著時間的推移出現(xiàn)氣泡至關(guān)重要。為此，在50 ml器中填充適量的培養(yǎng)基，并輕輕地將瓶蓋擰緊。在 µ-Slide 8孔載玻片開放孔井中，氣泡可排出到大氣中。

　　拆開µ-Slide的包裝，把它放在µ-Slide支架上，并在準(zhǔn)備細(xì)胞懸浮液時同時將蓋子放在 Luer 適配器/孔上。

　　4. 播種細(xì)胞

　　分離細(xì)胞：

　　吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，并用PBS洗滌細(xì)胞一次。每75cm² 燒瓶中加入3-5 ml的Accutase，并將燒瓶放入培養(yǎng)箱中以加快分離速度。如果是RAW-264.7細(xì)胞系，則大約需要8分鐘。使用Accutase分離的細(xì)胞存活率更高。

　　4.1. 將細(xì)胞接種到µ-Slide VI _^0.4中

　　在µ-Slide VI _^0.4建議的細(xì)胞濃度：最終細(xì)胞數(shù)  0.3 x 10 _⁵ cells/cm²，制備濃度6 x 10 _⁵cells/ml。通過將移液器尖端直接放在通道的入口上，將30 µl細(xì)胞懸浮液填充到每個通道中。將蓋子蓋在玻片上，在37°C和5％CO_²下孵育半小時以固定細(xì)胞。

　　細(xì)胞貼壁后，分別用60 µl無細(xì)胞培養(yǎng)基填充儲液池。 避免將移液器吸頭直接指向通道的入口。將玻片放回培養(yǎng)箱中。

　　圖1：接種后一小時，在ibiTreat µ-Slide VI _^0.4（貨號80606）中的RAW-264.7

　　圖2: 在ibiTreat µ-Slide VI _^0.4中的RAW-264.7，孵育24小時后

　　圖3:在ibiTreat µ-Slide VI_^0.4中的RAW-264.7，培養(yǎng)四天后

　　4.2 將細(xì)胞播種在µ-Slide 8 well 中

　　在µ-Slide 8 well建議的細(xì)胞濃度：最終細(xì)胞數(shù) 0.3 x 10 _⁵ cells/cm² ，制備濃度 1.1 x 10 ^₅ cells/ml。將300 µl 的細(xì)胞懸浮液注入各孔中。將蓋子蓋在玻片上，在37°C和5% CO_²中孵育。不需要進(jìn)一步添加培養(yǎng)基。

　　圖4：在ibiTreat µ-Slide 8 well(貨號：80826)中的RAW-264.7，播種后1小時

　　圖5: 在ibiTreat µ-Slide 8 well中的RAW-264.7，孵育24小時后

　　圖6：在ibiTreat µ-Slide 8 well中的RAW-264.7，經(jīng)過四天的培養(yǎng)

　　為獲得最佳的分布的勻的細(xì)胞，我們建議使用像µ-Slide VI ^_0.4 這樣的通道載玻片。在8孔腔室載玻片中，細(xì)胞密度可能會在孔的整個表面上因點(diǎn)而異，具體取決于細(xì)胞播種過程中的處理。

　　5. 免疫熒光染色

　　像往常一樣為您的細(xì)胞固定和染色。

　　注意：在 µ-Slides 中染色時注意液體的處理

　　µ-Slide VI _^0.4 ：更換液體，先吸出兩個儲液池而不排空通道。 如果您使用的是真空設(shè)備，請注意不要將吸頭直接放在通道的入口上。 用100 µl新溶液沖洗通道3次。 從一側(cè)添加新的溶液，通過通道流入另一個儲液池，然后從另一側(cè)吸出，直到兩個儲液池都排空。注意通道永遠(yuǎn)不要干涸！

　　µ-Slide 8孔載玻片：在 µ-Slide 8孔中，無需特殊處理措施。像在任何其他培養(yǎng)皿或孔板中一樣的交換液體。

　　下文中，給出了使用以下材料對細(xì)胞核和肌動蛋白絲進(jìn)行染色的示例：

　　細(xì)胞核：DAPI（Diamidino pheylindol dihydrochlorid） SIGMA, 32670 

　　肌動蛋白絲：Phalloidin, Alexa Fluor _^® 488 Conjugate, LONZA, PA-3010 

　　1. 用3.7% 的PFA在PBS（pH 7.4）中室溫下固定細(xì)胞10分鐘。

　　2. 用PBS清洗細(xì)胞三次。

　　3. 用Triton X 100（0.1%）孵育細(xì)胞5分鐘。

　　4. 用PBS清洗細(xì)胞三次。

　　5. 用1%牛血清白蛋白在PBS中孵育20分鐘。

　　6. 用PBS清洗細(xì)胞三次。

　　7. 在0.2μm濃度下用鬼筆環(huán)肽Alexa For 488孵育細(xì)胞20分鐘。

　　8. 用PBS清洗細(xì)胞三次。

　　9. 用DAPI（0.5μg/ml）孵育細(xì)胞10分鐘。

　　10. 用PBS清洗細(xì)胞三次。

　　11. 完全吸出通道并用ibidi封片劑重新填充。 現(xiàn)在樣品可在顯微鏡上觀察了。保存在陰暗陰涼處可儲存數(shù)周。

　　圖7：在 µ-Slide VI _^0.4中的RAW-264.7用DAPI（細(xì)胞核、藍(lán)色）和Phalloidin, Alexa Fluor ^_® 488 Conjugate（肌動蛋白絲，綠色）