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　　免疫熒光實(shí)驗(yàn)

　　

　　ibidi提供了一種簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)高效的方案，使用ibidi3孔可移除腔室載玻片（80381）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、固定和染色。培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞并用福爾馬林溶液固定。細(xì)胞核用DAPI染色，肌動(dòng)蛋白骨架用DYE-490鬼筆肽染色。可通過使用圓形的15mm蓋玻片來減少所需的染色溶液的量。利用一級(jí)和二級(jí)抗體染色，通過免疫細(xì)胞化學(xué)可以探測(cè)其他細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。

　　

　　實(shí)驗(yàn)使用的材料：

　　

　　所使用的材料和試劑如下所示。此外，還需要配備一臺(tái)有適當(dāng)濾光片組的倒置或正置熒光顯微鏡。

　　

　　

　　·3孔可移除腔室載玻片（ibidi，80381）

　　

　　·3孔可移除培養(yǎng)專用圓形15mm蓋玻片及配套工具，（ibidi，10815）

　　

　　·細(xì)胞：MCF-7（CLS，300273）

　　

　　·細(xì)胞培養(yǎng)基

　　

　　·細(xì)胞培養(yǎng)試劑

　　

　　·PBS

　　

　　·福爾馬林中性緩沖液，10％（Sigma，HT5011）

　　

　　·染色試劑

　　

　　o  DAPI（Sigma，D954）

　　

　　o  DYE-490鬼筆環(huán)肽（Dynomics，490-33）

　　

　　·封片劑：FluoroshieldTM（Sigma，F(xiàn)6182）

　　

　　實(shí)驗(yàn)方案

　　

　　細(xì)胞培養(yǎng)，固定，染色和成像觀察--都是在一個(gè)開放型小室中搞定：）

　　

　　

　　第1步：

　　

　　必須在預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定細(xì)胞系的正確接種濃度。根據(jù)您的細(xì)胞類型，用2-6x10⁴細(xì)胞/ml在2-3天內(nèi)產(chǎn)生匯合的單層。

　　

　　1. 在無菌條件下，打開3孔可移除腔室載玻片（ibidi，80381）包裝。

　　

　　2. 像往常一樣對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶化和計(jì)數(shù)。MCF-7細(xì)胞濃度為3×10⁴細(xì)胞/ml 。

　　

　　3. 將1100μl細(xì)胞懸浮液加入腔室的每個(gè)孔中。避免搖晃，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻。為獲得更均勻的細(xì)胞分布，請(qǐng)使用3孔可移除培養(yǎng)專用圓形15mm蓋玻片。

　　

　　4. 用配套的蓋子蓋住。在37°C和5％CO₂下培養(yǎng)。

　　

　　5. 細(xì)胞至少培養(yǎng)24小時(shí)，或直到建立融合的單層。

　　

　　

　　第2步：

　　

　　固定是染色程序的第一步。目的是將細(xì)胞、細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組織維持在當(dāng)前狀態(tài)，并通過化學(xué)試劑在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保存制劑。

　　

　　1.小心地抽吸細(xì)胞培養(yǎng)基。

　　

　　2.用PBS洗兩次。

　　

　　3.加入1100μl福爾馬林溶液。

　　

　　4.室溫下孵育30分鐘。

　　

　　5.小心地抽吸福爾馬林溶液。

　　

　　6.用PBS洗滌三次

　　

　　

　　第3步：

　　

　　應(yīng)根據(jù)感興趣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)選擇染色試劑。在該方案中使用DAPI和DYE-490鬼筆環(huán)肽染色MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞核和肌動(dòng)蛋白骨架。

　　

　　1.準(zhǔn)備你的染色溶液：

　　

　　· PBS

　　

　　· DYE-490鬼筆環(huán)肽（每單元/玻片，50 μl/單元）

　　

　　· DAPI 1μg/ml

　　

　　2.小心吸出PBS。

　　

　　3.用蓋玻片拾取工具抓取15毫米的圓形蓋玻片，并將其放置在腔室孔內(nèi)的圓形邊緣上。

　　

　　4.將移液管尖端插入其中一個(gè)角槽中，將150μl染色液移入孔中。

　　

　　5.在室溫下避光孵育30分鐘

　　

　　

　　第4步：

　　

　　染色后清洗樣本可最大限度地減少背景信號(hào)

　　

　　1.通過在一個(gè)角槽中添加950μl緩沖液來移除蓋玻片。

　　

　　2.用Coverslip Pick-Up Tool蓋玻片拾取工具或鑷子抓取漂浮的蓋玻片，將其從孔中取出。

　　

　　3.如有必要，重復(fù)洗滌步驟，抽吸緩沖液并在每孔中移液1100μl緩沖液。圓形的15毫米蓋玻片無需額外的洗滌步驟。

　　

　　

　　第5步：

　　

　　從一個(gè)邊緣開始，用手或用鑷子小心地取下硅膠墊圈。該步驟應(yīng)以緩慢，穩(wěn)定的進(jìn)行，以避免損壞細(xì)胞層。

　　

　　

　　第6步：

　　

　　完成染色程序后，必須在用顯微鏡成像之前封固樣品。該步驟還可防止樣品脫水。

　　

　　1.將載玻片側(cè)面在干凈的實(shí)驗(yàn)室濕巾上輕敲，去除樣品中多余的介質(zhì)。

　　

　　2.將封固劑涂在樣品上。用24 x 60毫米的蓋玻片覆蓋安裝好的樣品，小心地將蓋玻片放到封片劑上，以避免夾住任何氣泡。

　　

　　Tip：建議使用硬化封片劑，如FluoroshieldTM (Sigma-Aldrich), Vectashield? (Vector Laboratories Inc.), or ProLong Antifade? (ThermoFisher Scientific)。

　　

　　3.等封片劑固定好。

　　

　　

　　第7步：顯微觀察

　　

　　使用可移除3孔腔室載玻片培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞。用DAPI和染料490對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行染色。圓形15mm蓋玻片減少了所需的染色溶液的量。用硬化封片劑安裝載玻片，可使樣品長(zhǎng)期保存。

　　

　　

　　圖1 MCF-7細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白骨架用DYE 490鬼筆肽染色（左上），細(xì)胞核用DAPI染色（右上）。下圖顯示了合成圖像，細(xì)胞核為藍(lán)色，肌動(dòng)蛋白骨架為綠色。（比例尺：100μm）

　　

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