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　　前言

　　本應(yīng)用說明介紹了一種在µ-Slide VI _0.4 µ-Pattern ibiTreat(cir200. pit600. hex)微圖案六通道載玻片上培養(yǎng)、固定及染色細(xì)胞或細(xì)胞球狀體的簡單方案。ibidi µ-Patterns在ibidi Polymer聚合物蓋玻片上提供空間定義的ibiTreat(組織培養(yǎng)處理)粘附微圖案區(qū)域，周圍區(qū)域環(huán)繞著生物惰性Bioinert(ULA)，以確保細(xì)胞僅在定義的微圖案區(qū)域形成3D聚集體。

　　在此示例中，人肝細(xì)胞(Huh7)培養(yǎng)在多細(xì)胞陣列上，并用福爾馬林溶液固定，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、α-微管蛋白和細(xì)胞核被標(biāo)記用于熒光顯微鏡觀察。

　　1. 實(shí)驗(yàn)材料

　　1.1 試劑與緩沖液

　　* 貼壁細(xì)胞，例如Huh-7(JCRB: #JCRB0403)

　　* 細(xì)胞培養(yǎng)基;例如，含10%胎牛血清(Gibco,10270106)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI-1640(Gibco,11875093)

　　* 磷酸緩沖鹽溶液(PBS;14190144.Gibco)

　　* Accutase(A11105.Gibco)，或其他適合用于細(xì)胞收集的解離試劑

　　* 磷酸緩沖鹽溶液(PBS;14190144.Gibco)

　　* 福爾馬林，10%，即用型(HT5011.Sigma Aldrich)

　　* Triton-X-100(A16046.Thermo Fisher Scientific)

　　* 透化緩沖液(含0.5% Triton-X-100的PBS)

　　* 牛血清白蛋白(BSA)(A1470-10G,Sigma Aldrich)

　　* 封閉緩沖液(含1% BSA的PBS)

　　* 抗體稀釋緩沖液(1% BSA和0.05% Triton-X-100溶于PBS)

　　* 鬼筆環(huán)肽-iFluor 488(ab176753.Abcam)

　　* 單克隆抗-α-微管蛋白抗體(T5168.Sigma-Aldrich)

　　* 抗小鼠IgG-Atto 594二抗(76085.Sigma-Aldrich)

　　* 含DAPI的ibidi封片劑(50011.ibidi)

　　* ibidi浸油2(50102.ibidi)

　　1.2 設(shè)備

　　* µ-Slide VI _0.4 µ-Pattern _{ibiTreat, cir200. pit600. hex} (83612. ibidi)

　　* µ-Slide Rack 載玻片支架(80003. ibidi)

　　* 標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備(移液器、無菌工作臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)基、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板等)

　　* 具有相應(yīng)濾光片組的倒置熒光顯微鏡

　　2. 實(shí)驗(yàn)步驟

　　2.1 細(xì)胞接種與培養(yǎng)

　　操作µ-Slide VI _0.4 µ-Pattern _{ibiTreat cir200. pit600. hex} 前請(qǐng)閱讀說明書。所有步驟均需在無菌條件下進(jìn)行。建議在接種細(xì)胞前一天將載玻片和細(xì)胞培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中，以避免操作過程中產(chǎn)生氣泡。在實(shí)驗(yàn)開始前，請(qǐng)將Huh-7細(xì)胞接種于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶(例如T75培養(yǎng)瓶)中，使細(xì)胞貼壁生長于瓶底。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，細(xì)胞應(yīng)處于亞匯合狀態(tài)且狀態(tài)良好。

　　整個(gè)操作過程中需快速進(jìn)行，以防止細(xì)胞干燥。

　　除非另有說明，所有提及的體積均指每通道所需體積，所有孵育步驟均在室溫下進(jìn)行。

　　* 向T75培養(yǎng)瓶中加入10 ml Accutase用于細(xì)胞解離;在培養(yǎng)箱中(37 °C，5 % CO?)孵育5分鐘。

　　* 收集細(xì)胞懸液，離心，并用少量細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋以進(jìn)行計(jì)數(shù)。

　　* 計(jì)數(shù)細(xì)胞，并用細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整至最終濃度為0.5–3 × 106個(gè)細(xì)胞/毫升。

　　注意：根據(jù)所使用的細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)需求優(yōu)化細(xì)胞接種濃度。如需進(jìn)一步了解影響細(xì)胞在ibidi µ-Patterns上附著的重要參數(shù)，請(qǐng)點(diǎn)擊查看

　　Application  Note  65:  Cell  Adhesion  on  ibidi  µ-Patterns: Parameters and Optimization.

　　* 拆開µ-Slide VI _0.4 µ-Pattern _{ibiTreat cir200. pit600. hex} 載玻片，將其放置在µ-Slide載玻片支架或適當(dāng)?shù)谋砻嫔稀?/span>

　　* 用移液器直接將30 µl細(xì)胞懸液加至每個(gè)通道中。快速加樣有助于避免氣泡滯留。對(duì)所有通道重復(fù)此操作。

　　* 如有必要，通過傾斜µ-Slide并輕敲其一側(cè)邊緣，去除通道中滯留的氣泡。

　　* 用隨附的蓋子蓋住儲(chǔ)液池。

　　* 將載玻片連同支架放入培養(yǎng)箱(37°C，5% CO²)中，讓細(xì)胞貼壁1小時(shí)。

　　* 向每個(gè)儲(chǔ)液池中加入60 µl無細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基。避免氣泡滯留。

　　* 將載玻片連同支架放入培養(yǎng)箱(37°C，5% CO²)中，將細(xì)胞培養(yǎng)過夜。

　　* 如有必要，次日可用無細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌以去除未貼壁的細(xì)胞和碎片。

　　* 對(duì)于長期細(xì)胞培養(yǎng)，建議每1-2天進(jìn)行一次持續(xù)的培養(yǎng)基更換(見本文2.2 通道中的洗滌與持續(xù)培養(yǎng)基更換 )。在本示例中，細(xì)胞在圖案上培養(yǎng)了10天。

　　2.2 通道中的洗滌與持續(xù)培養(yǎng)基更換

　　* 小心移除儲(chǔ)液池中的培養(yǎng)基。吸液時(shí)遠(yuǎn)離通道，以防將通道內(nèi)的液體一并吸出。

　　* 輕柔地將120 µl無細(xì)胞培養(yǎng)基加入一個(gè)儲(chǔ)液池，以補(bǔ)充通道中的培養(yǎng)基。

　　* 吸出對(duì)側(cè)儲(chǔ)液池中的舊培養(yǎng)基。使用細(xì)胞培養(yǎng)吸液裝置時(shí)需格外小心，以免沖走部分已貼壁細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)。

　　* 每個(gè)儲(chǔ)液池使用60 µl無細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)液。

　　Huh-7細(xì)胞在六通道載玻片ibiTreat µ-Pattern (200 µm circles, 600 µm pitch, hexagonal)上培養(yǎng)10天后的相差顯微鏡圖像。比例尺=100 µm

　　2.3 固定、透化與封閉

　　* 所有步驟需快速進(jìn)行，以確保通道不會(huì)干燥。吸液時(shí)避免直接從通道中吸取，以防將通道內(nèi)的液體吸走。為實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備足量的透化緩沖液和封閉緩沖液。

　　* 通過持續(xù)培養(yǎng)基更換，用PBS替換細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行洗滌(見本文2.2 通道中的洗滌與持續(xù)培養(yǎng)基更換)。

　　* 吸出儲(chǔ)液池中大部分PBS。切勿將整個(gè)通道內(nèi)的液體全部吸干。

　　* 用100 µl福爾馬林(10%)固定細(xì)胞20分鐘。

　　* 通過持續(xù)培養(yǎng)基更換，用200 µl PBS洗滌細(xì)胞兩次。

　　* 吸出儲(chǔ)液池中的PBS。注意不要將通道內(nèi)的全部液體吸干。

　　* 向其中一個(gè)儲(chǔ)液池中加入100 µl透化緩沖液，孵育細(xì)胞5分鐘。

　　* 通過持續(xù)培養(yǎng)基更換，用200 µl PBS洗滌細(xì)胞兩次。

　　* 吸出儲(chǔ)液池中的PBS。注意不要將通道內(nèi)的液體全部吸干。

　　* 用100 µl封閉緩沖液在室溫下封閉20分鐘。

　　* 按照前述步驟，用200 µl PBS洗滌細(xì)胞兩次。

　　2.4 染色

　　* 在抗體稀釋緩沖液中稀釋鬼筆環(huán)肽和抗-α-微管蛋白抗體(均按1:500稀釋，或根據(jù)制造商的建議)制備一抗染色液。

　　* 通過持續(xù)更換，用100 µl一抗染色液替換通道中的封閉緩沖液，然后在避光條件下孵育過夜。

　　* 按照前述步驟用PBS洗滌兩次。

　　* 在抗體稀釋緩沖液中稀釋二抗(1:500.或根據(jù)制造商的建議)制備二抗染色液。

　　* 用100 µl二抗染色液替換通道中的PBS，并在室溫避光孵育1小時(shí)。

　　* 用PBS洗滌三次。

　　2.5 封片

　　* 吸出所有PBS(此時(shí)可吸走整個(gè)通道內(nèi)的液體!)，并立即加入含DAPI的ibidi封片劑(ibidi Mounting Medium With DAPI)進(jìn)行細(xì)胞核染色，直至通道充滿。如果使用其他封片劑，請(qǐng)注意其必須為非干燥型，以避免損壞µ-Slide載玻片。

　　* 避光于4 °C保存直至成像。

　　* 染色后的µ-Slide可保存長達(dá)4周。但建議盡快進(jìn)行成像，因?yàn)榇娣艜r(shí)間過長可能會(huì)降低圖像質(zhì)量。

　　2.6 成像

　　* 使用配備適當(dāng)濾光片的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，必要時(shí)可滴加ibidi浸油。

　　* 可選：疊加通道圖像以生成合并圖像。

　　3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

　　Huh-7細(xì)胞在µ-Slide VI _0.4六通道載玻片中，貼附于ibiTreat µ-Pattern(200 µm circles, 600 µm pitch, hexagonal)微圖案表面的寬場(chǎng)熒光顯微鏡圖像。F-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架通過鬼筆環(huán)肽(綠色)進(jìn)行可視化。細(xì)胞核用DAPI染呈藍(lán)色，微管蛋白呈紅色。成像在尼康TiE倒置顯微鏡上使用4倍物鏡進(jìn)行。比例尺=100 µm。